兩種新型抗血栓藥物——水蛭素與水蛭肽

當今世界正步入老年社會, 僅我國50歲以上的人口就有3億之多。血栓病是老年人的常見病,全世界有血栓栓塞性病人約1 500, 萬所需溶栓劑的潛在市場約20億美元。早期的抗(溶)血栓藥物有纖維蛋白原溶解酶、尿激酶、鏈激酶等,但它們的臨床應用有幾個顯著的缺點,如: 凝血酶會高比例再生等。而小的合成抑制因子如三肽d-Phe- Pro- Arg雖然具有高選擇的抗凝血酶活性,但其半衰期僅有幾分鐘。水蛭素無論是皮下注射還是靜脈注射都無明顯的副作用,壽命約50min。水蛭肽做為第2代溶栓劑也受到日益廣泛的關注。

1　水蛭素與水蛭肽

水蛭(學名)又名螞蟥,是一種生長于沼澤、湖泊或水田中的環節動物,以吸食人畜的血液為生。水蛭是較強的活血化瘀藥物,據《神農本草經》記載: “水蛭味咸平, 主逐惡血,月閉, 破血瘕集聚,無子, 利水道?！睔W洲的John Haycraft博士在1884年發現歐洲醫用水蛭會分泌出某種阻止血液凝結的物質以利于水蛭吸食血液消化。在20世紀初人們發現這種物質是一種蛋白質,并命名為水蛭素(Chirudin)。目前我們已經知道水蛭素并非是一種純凈物,而是一個具有同源結構的多肽化合物家族。這一家族中至少有3種分子,分別被命名為水蛭素-1、水蛭素-2、水蛭素-3,縮寫為HV1、 HV2、 HV3。水蛭素可以與凝血酶(thrombin)按1∶1的比例以非共價的形式緊密結合成可逆復合物,從而阻止凝血酶催化的止血反應及凝血酶誘導的血小板激活反應,達到抗凝血的目的。水蛭肽( Hirulog)這一名稱最初由J·M· Maraganore提出,是人們模仿水蛭素與凝血酶的相互作用機制,設計后通過化學合成或微生物發酵而得到的肽類凝血酶抑制劑。水蛭肽與水蛭素的抗凝血

作用使得它們在臨床上可用于阻止靜脈血栓和血管成形術后的血栓形成等,具有極高的醫用價值。

2　水蛭素的性質、結構及其抗凝血機理

天然水蛭素是由65或66個氨基酸殘基組成的單鏈多肽,分子量約為7000,能在極端的pH和熱條件下穩定存在。水蛭素的形狀類似蝌蚪,蝌蚪頭部是多肽的N端,富含半胱氨酸(cys), 半胱氨酸間相互作用形成3個二硫鍵( Cys6- Cys14, Cys16- Cys28, Cys22- Cys39)。使N末端結構緊密; 蝌蚪尾部是含有多個酸性氨基酸和一個被磺酸化的酪氨酸( Tyr63)的多肽C末端。凝血酶(thrombin)是血液凝固和止血過程中的中心酶,它不但能剪切纖維蛋白原,將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白; 還能激活其它的凝固血液的酶類,如凝血因子Ⅴ、Ⅷ、ⅩⅢ和抗凝血酶蛋白C(Fenton,1981)等。凝血酶與大分子底物的相互作用取決于三個不同的區域:催化反應位點的初級結合位點C(Magnusen, 1971),鄰近催化位點的非極性結合位點AB(Brlinrand Shen, 1977; Sonder and Fenton, 1984)和負責凝血酶與纖維蛋白原專一性作用的陰離子結合位點(識別位點)   R(Fenton et al. 1989; Henriksenand Mann, 1988)。水蛭素的N端能封阻凝血酶的活性位點,其疏水結構域與凝血酶的非極性結合位點( AB)互補,該非極性結合位點靠近凝血酶的催化中心。水蛭素C末端有6個酸性氨基酸, 能與帶正電的凝血酶識別位點形成許多離子鍵。N端、C端兩個功能域以協同的方式結合到凝血酶上, 在凝血酶的活性部位形成一個帽子,阻止底物的結合。為了更好地了解水蛭素結構對性能的影響,人們對于水蛭素的N端、C端和各位點做了大量研究,得出許多結論,為水蛭肽的設計打了堅實的理論基礎。各種研究表明水蛭素C末端的10個氨基酸是必需的最小結構, C末端的最佳大小至少是12個氨基酸( Hir54- 65),在這一序列中每個氨基酸都非常重要。幾個疏水殘基和酸性殘基對于維持水蛭素C末端的功能非常重要。

3　水蛭肽的結構與功能

水蛭肽(hirulog)是以水蛭素為模板設計出的肽類凝血酶抑制劑,其氨基酸數目與順序也因設計者的不同而不同。最初的水蛭肽是由Maraganore等設計的, 具有20個氨基酸殘基, 含有2個結構域(domain)和一個連結區。其中C端是由水蛭素羧基末端衍化來的,能與凝血酶的催化反應位點緊密結合。在水蛭肽的設計中,現在公認應由三部分組成: 水蛭素羧端10肽、凝血酶催化活性位點的特異識別序列和二者間的功能連接橋。

水蛭肽通過(d- Phe)- Pro- Arg-Pro序列直接與凝血酶活性部位結合,如果用1- Phe取代N端的d- Phe,水蛭肽的抗凝血酶活性將大幅度地降低;當將(d- Phe)- Pro- Arg- Pro序列全部去除時, 在濃度不高于10μm時將測不到對凝血酶的抑制性。水蛭肽對凝血酶的作用機理不完全同于水蛭素,其半壽期也會有所不同。此外, 體外實驗還顯示水蛭肽對與纖維蛋白(血凝塊)結合的凝血酶的抑制作用比水蛭素強。

4　臨床效果

國內外學者通過動物模型和志愿者試驗,對水蛭素(肽)的藥理特性進行了大量的研究。俄羅斯科學家通過對57名患不同疾病(冠心病、風濕病、慢性肺病)的病人進行試驗,確認水蛭素對防止血凝是有效的, Markwardt等的研究也顯示了水蛭素對人具有良好的抗血栓作用。水蛭肽在動物實驗中也顯示了良好的抗凝和抗血栓作用。進入20世紀90年代后,人們將水蛭肽在接受心血管術的冠心病患者、不穩定性心絞痛患者和冠脈成型術中進行了臨床試驗, 均取得了較理想的效果。

與現在應用最廣泛的抗凝血酶藥物——肝素相比,水蛭素與水蛭肽具有以下優點: 第一,水蛭素與水蛭肽抑制凝血酶的反應不需要抗凝血酶Ⅲ( AT—Ⅲ)作為輔助因子, 使其抗凝作用與量效關系更吻合而且可在缺乏抗凝血酶Ⅲ的病人(如彌漫性血管內凝血)中使用;

第二,肝素不能滅活結合于血栓上的凝血酶,而水蛭素與水蛭肽則對循環中的和結合于血栓上的凝血酶都可以抑制; 第三,肝素會被激活的血小板釋放的血小板因子4(PTF4)或富含組氨酸的糖蛋白等結合,而水蛭素與水蛭肽則不受這些因素的影響; 第四,水蛭素與水蛭肽用于抗血栓治療,出血副作用較小,且無過敏反應和免疫原性,無毒反應。天然水蛭素的醫用價值早已受到普遍重視,但由于天然材料來源

的限制,人們將注意力轉向用基因工程手段生產的重組水蛭素及其多肽,成功采用的表達系統有大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞以及哺乳動物細胞等,并研究了純化程序及其臨床應用。目前,世界上許多公司正努力將重組水蛭素及水蛭肽用于開發新藥,意大利、法國、德國、瑞士、美國等均有公司在進行研究,并且已有公司在中國申請專利, 我國也有幾個單位正在開展這方面的研究。重組水蛭素與水蛭肽正式用于臨床后,將會逐步取代肝素的主導抗栓劑地位。